目前已有6種基于嵌合抗原受體（CAR）修飾的免疫細(xì)胞的過繼細(xì)胞療法（ACT）被批準(zhǔn)用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞因其多種殺傷機(jī)制、更高的安全性和更廣泛的來源而受到越來越多的關(guān)注。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）來源的NK（iPSC-NK）細(xì)胞具有成熟的表型和強(qiáng)大的細(xì)胞溶解活性，可以提供一個(gè)同質(zhì)的CAR-NK細(xì)胞群體，并擴(kuò)展到臨床規(guī)模。因此，iPSC衍生的CAR-NK（CAR-iNK）細(xì)胞可以作為癌癥免疫治療的標(biāo)準(zhǔn)化和“通用型”產(chǎn)品。
NK細(xì)胞主要有四種來源：外周血、臍帶血、永生化細(xì)胞系（如NK-92）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）來源的NK細(xì)胞，其中外周血來源又可以分為自體來源和供體來源。下表總結(jié)了不同來源的NK細(xì)胞在免疫治療中的優(yōu)缺點(diǎn)。
表1 不同來源NK細(xì)胞在免疫治療領(lǐng)域的優(yōu)缺點(diǎn)
細(xì)胞來源
優(yōu)點(diǎn)
缺點(diǎn)
供體外周血
細(xì)胞成熟無需分化，已證明有臨床療效
分離困難，產(chǎn)量低
自體外周血
無同種異體反應(yīng)
依賴患者免疫細(xì)胞質(zhì)量，擴(kuò)增困難，滯后時(shí)間長
臍帶血來源CD34+細(xì)胞
可大量體外分化
未成熟，細(xì)胞殺傷毒性小
NK-92細(xì)胞系
均一細(xì)胞群，無限擴(kuò)增
不表達(dá)CD16，缺乏ADCC功能，安全性未知，輻照后效果減弱
iPSC
容易獲得，克隆生長、高擴(kuò)增及體外分化
安全性未知
目前尚不完全清楚iPSC-NK細(xì)胞是否需要相同的激活途徑來誘導(dǎo)脫顆粒和細(xì)胞因子分泌。盡管如此，大量數(shù)據(jù)證實(shí)了iPSC-NK 結(jié)合了原代 NK 細(xì)胞和 NK-92 細(xì)胞系最具吸引力的優(yōu)勢，即：高潛在的細(xì)胞毒性（包括 ADCC 功能）和即使冷凍保存后也能在體內(nèi)擴(kuò)增和持久存在的能力。
iPSC-NK細(xì)胞分化方案可以分為2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)兩種，兩種方式都需要通過誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞（HPC）后獲得NK細(xì)胞。
01 iPSC-NK 2D培養(yǎng)
在最早的一種方案中，Kauffman團(tuán)隊(duì)使用兩步體外2D分化方案，將人PSCs與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)以促進(jìn)造血分化，然后將分選的HPCs與第二步的基質(zhì)細(xì)胞系和包括IL-15、IL-3、IL-7、SCF和Flt3L的細(xì)胞因子混合物共培養(yǎng)以產(chǎn)生PSC衍生的NK細(xì)胞。其他組已經(jīng)用表達(dá)Notch配體DLL1或DLL4的基因工程飼養(yǎng)細(xì)胞取代了第二步的基質(zhì)細(xì)胞系，這些工程改造的細(xì)胞可以促進(jìn)HPCs向NK譜系的分化和擴(kuò)增
在2D培養(yǎng)方案中，飼養(yǎng)層體系因其高分化效率在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。飼養(yǎng)層細(xì)胞能分泌生長因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)干細(xì)胞特定方向分化，為研究者提供豐富的細(xì)胞資源。然而，其在臨床應(yīng)用中因安全性問題受限，如可能攜帶病原體、引發(fā)免疫排斥等，因此，臨床研究者們更傾向于采用更為安全、可控的培養(yǎng)方案。
在非飼養(yǎng)體系中，干細(xì)胞的增殖和分化高度依賴于外源添加的細(xì)胞因子，通過在培養(yǎng)基中添加BMP4，VEGF，F(xiàn)GFb，TPO，IL-11，IGF-1，SHH，Transferrin等細(xì)胞因子，促使iPSC分化成為造血干細(xì)胞。然后添加IL-15，IL-3，IL-7，SCF，F(xiàn)lt-3L等多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)其分化生成NK細(xì)胞。
02 iPSC-NK 3D培養(yǎng)
在3D培養(yǎng)方案中，iPSC在沒有飼養(yǎng)層（低吸附板）的懸浮液中培養(yǎng)時(shí)，它們會(huì)自發(fā)地形成擬胚體（EB），EB中的細(xì)胞響應(yīng)外源性細(xì)胞因子信號，生長和分化為特定的細(xì)胞譜系，在DLL4蛋白包被的板子和包含細(xì)胞因子的分化培養(yǎng)基中最終得到NK細(xì)胞。
iPSC分化為NK細(xì)胞的3D方案示意圖
通過無飼養(yǎng)層體系胚狀體形成方法將iPSC分化為NK細(xì)胞，簡單的培養(yǎng)過程如下：未分化的iPSC細(xì)胞克隆使用TrypLE select處理后轉(zhuǎn)移至低吸附板，并在含有10μmol/L Y‐27632的iPSC培養(yǎng)基中孵育過夜，以形成胚狀體（EB）。收集EB并將其轉(zhuǎn)移到EB培養(yǎng)基中，并在40 ng/mL BMP‐4、10 ng/mL bFGF和50 ng/mL VEGF的存在下培養(yǎng)。第4天，EB與細(xì)胞因子混合物（50 ng/mL SCF、20 ng/mL Flt3L、20 ng/mL IL‐3和30 ng/mL TPO）一起培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第14天，將分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到FcDLL4包被的培養(yǎng)板上，并在細(xì)胞因子混合物（10 ng/mL Flt3L，5 ng/mL IL-7）的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)21天后，造血細(xì)胞分化為CD7+、CD45+淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞（iLPC）。采集iLPC并用PHA刺激其擴(kuò)增以產(chǎn)生iNK[5]（圖3）。
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