當?shù)孜锇l(fā)生化學反應而產生的能量以光的形式釋放出來的時候，我們稱這個過程為化學發(fā)光。魯米諾（luminol）是最常用的化學發(fā)光試劑之
一，被過氧化物氧化后它會產生一種激發(fā)態(tài)的產物——aminophthalate。這種產物衰變至低能態(tài)的同時釋放出光子。專利添加物可以提高魯米諾反
應的發(fā)光強度和持續(xù)時間以及靈敏度。
化學發(fā)光底物被廣泛使用是因為其具有其他檢測方法不具備的優(yōu)點，這些優(yōu)點使得化學發(fā)光成為大多數(shù)蛋白實驗室首選的檢測方法。使用化
學發(fā)光可以通過多次曝光獲得最好的成像結果。還可以將檢測試劑完全去除，再對其他目的蛋白進行檢測并成像，或對檢測條件進行優(yōu)化。具有很
寬的線性響應范圍，從而可以檢測并定量很寬濃度范圍的蛋白質。最重要的是，化學發(fā)光在所有的檢測方法中具有最高的靈敏度。使用辣根過氧化
物酶標記的抗體和G-Biosciences公司的femtoLUCENT? PLUS (貨號 # 786-003)，可以檢測的下限為飛克級，而這得益于這種底物中的增強劑
可以很大程度地增強發(fā)光強度并提高靈敏度。
化學發(fā)光底物與其他底物不同之處在于只有在酶和底物發(fā)生反應的時候才會產生瞬時的可被檢測的光。這與那些可產生穩(wěn)定有顏色產物的底
物不同；些有顏色的沉淀在酶-底物反應結束之后仍然存在于膜上。在化學發(fā)光免疫印跡中，底物是反應限制試劑。一旦其耗盡，光就會逐漸變弱并
消失。實驗中一定要使用適當稀釋濃度的抗體，這樣才會在幾小時內產生穩(wěn)定的光信號輸出，從而維持蛋白檢測的一致性和靈敏度。當抗體沒被足
夠稀釋時，永遠不會獲得穩(wěn)定的光信號輸出。系統(tǒng)中太多的酶會快速氧化底物并終止信號。
化學發(fā)光，魯米諾在HRP和雙氧水存在的條件下會被氧化形成激發(fā)態(tài)的產物（3-aminophthalate）。3-aminophthalate在衰變至基態(tài)的過程中會
發(fā)出波長為425nm的光。
femtoLUCENT? PLUS
化學發(fā)光的優(yōu)點
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靈敏性 |
?強信號，低背景 ?只需很少的抗原和抗體 |
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快速 |
?印跡上快速的底物處理 ?信號在幾秒鐘之內產生 |
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穩(wěn)定 |
?與放射性同位素不同，存放期很長 ?4oC儲存 |
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硬拷貝結果 |
?用X光膠片捕獲結果 ?結果不會隨時間而褪色，不用擔心膜的破裂 ?永久保存 |
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膠片結果 |
?信號隨曝光時間增強而增強 ?可選擇在不同時間曝光 ?可優(yōu)化顯色的方法 |
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印跡可重新檢測 |
?非同位素標記的探針可從膜上洗掉 ?可重復進行免疫檢測 |
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寬線性范圍 |
?可檢測很寬范圍的蛋白濃度 |
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可定量 |
?可用反射型顯象密度計或成像設備 （例如CCD相機）掃描X光膠片 |
