一旦蛋白質(zhì)被SDS-PAGE或二維電泳分離, 蛋白可以通過不同的染色步驟進(jìn)行觀察。對于這個(gè)應(yīng)用，世界上大部分實(shí)驗(yàn)室使用三種常規(guī)的蛋白染
色技術(shù): 考馬斯亮藍(lán), 銀染色或熒光染色. 因此, 你如何知道哪種染色最適用于質(zhì)譜?下面是你需要了解的信息來幫助你做出正確的決策。
凝膠染色101: 理解基礎(chǔ)原理
操作完SDS-PAGE之后, 將膠盒拆掉，薄的聚丙烯酰胺膠被放置到裝有水或者合適緩沖液的托盤上。電泳后的蛋白，呈現(xiàn)出濃縮條帶鑲嵌到凝膠
基質(zhì)中，結(jié)合到陰離子SDS去污劑中. 為了使這些條帶可見，這些凝膠基質(zhì)需要被蛋白特定性的，染料結(jié)合或顏色產(chǎn)生化學(xué)物，比如銀染試劑或考馬
斯亮藍(lán)試劑.
為了得到最好的結(jié)果，您選擇的染色技術(shù)應(yīng)該可以提供有力的，快速，以及簡單的步驟，同時(shí)應(yīng)該有高靈敏度和高的重復(fù)性，以及廣泛的線性
動(dòng)力學(xué)范圍。除此之外，它應(yīng)該兼容于下游的技術(shù)比如蛋白抽提和定量, 蛋白印跡, 以及質(zhì)譜。
哪種蛋白染色可以選擇用于下游的質(zhì)譜？
所有的染色技術(shù)有他們自己的優(yōu)勢和缺點(diǎn)因此您確實(shí)需要了解更多這樣才可以做出正確選擇。
銀染試劑
銀染染色是目前來說最靈敏的顯色方法用于檢測和觀察蛋白. 這種技術(shù)利用銀離子能夠強(qiáng)烈的結(jié)合到某些蛋白功能集團(tuán)上，比如羧酸集團(tuán)(Asp
和 Glu),咪唑(His), 硫氫基 (Cys), 以及氨基 (Lys). 在顯色溶液的幫助下，銀離子還原成銀金屬從而出現(xiàn)了可視化的條帶.
既然這種技術(shù)提供最高的靈敏度 (它可以用于檢測低于1ng的蛋白) 同時(shí)對于涉及到微量蛋白的應(yīng)用來說會非常有用,同時(shí)它在使用中也有很多
缺點(diǎn). 包括如下:
· 它是時(shí)間和勞動(dòng)密集型的. 染色過程涉及多個(gè)步驟和試劑，凝膠染色之后需要加入顯色劑. 因?yàn)轱@色需要的時(shí)間在各個(gè)膠之間變動(dòng)很大，使用
這個(gè)技術(shù)不能保證在定量分析中足夠的重復(fù)性。
· 狹窄的線性動(dòng)力學(xué)范圍. 這使得銀染不是非常適合進(jìn)行定量.
· 不能染色所有的蛋白. 銀染不好的地方在于不能對于常見翻譯后的蛋白修飾，比如糖蛋白和磷酸化蛋白進(jìn)行染色。
· 對于下游的應(yīng)用提供有限的兼容性。傳統(tǒng)的銀染要求使用戊二醛或甲醛，這些化學(xué)物質(zhì)能夠?qū)е履z中蛋白的化學(xué)交聯(lián)。這限制了兼容方法
的數(shù)量用于質(zhì)譜分析。最新的質(zhì)譜兼容銀染方法已經(jīng)有商用的產(chǎn)品能夠提供更大的兼容性，但是仍然和傳統(tǒng)的銀染方法一樣有相同的缺點(diǎn)。
考馬斯亮藍(lán)染色
這可能是在全世界實(shí)驗(yàn)室中最廣泛了解的蛋白染色技術(shù). 有兩種主要類型的考馬斯亮藍(lán)染色， - 原始考馬斯亮藍(lán)染色和膠質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色.
在經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)中，蛋白凝膠和考馬斯亮藍(lán)染料溶液一起孵育。因?yàn)檫@個(gè)過程染色所有的凝膠，所以之后通常使用甲醇/乙酸的脫色溶
液進(jìn)行漂洗來使蛋白條帶可視化。
然而這種技術(shù)相對于銀染來說被認(rèn)為靈敏度不夠(它的檢測極限是大約100ng)以及有低的可重復(fù)性。許多科研人員習(xí)慣于使用這種技術(shù)是因?yàn)?
它比較便宜以及操作簡單。除此之外，它不會修飾靶蛋白以及和質(zhì)譜兼容。這個(gè)技術(shù)也被證明是足夠充分的對于簡單的任務(wù)比如可視化重組蛋白或
生產(chǎn)抗體.
為了克服銀染和原始考馬斯亮藍(lán)技術(shù)的局限性，研發(fā)人員現(xiàn)在使用膠質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色來替代. 這種技術(shù)提供更高的靈敏度 (檢測極限大約
4ng) 和可重復(fù)性 (這種膠質(zhì)染料不會滲透到膠中因此它不需要脫色)和原始考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)相比.除此之外，它對于涉及到低蛋白水平檢測來說
是理想的應(yīng)用同時(shí)和質(zhì)譜非常兼容。
考馬斯亮藍(lán)染色主要的缺點(diǎn)在于比較低的靈敏度以及在質(zhì)譜分析之前染料必須去除。
熒光染料
市場上有大量的熒光染料，他們中的絕大多數(shù)和質(zhì)譜是兼容的?；驹碓谟跓晒馊玖虾偷鞍捉Y(jié)合后能夠被特定波長的發(fā)射熒光激活。熒光蛋
白染色和銀染有相似的靈敏度，同時(shí)顯示出增強(qiáng)的質(zhì)譜效果。.
熒光染色確實(shí)也有一些缺點(diǎn)包括比較長的操作步驟(在一些情況下需要5個(gè)小時(shí)), 成本和仍然需要在質(zhì)譜分析之前進(jìn)行脫色.
反向染色
反向染色經(jīng)常被忽視用于質(zhì)譜的染色蛋白凝膠, 但是它和上面的染色方法相比確實(shí)有一些優(yōu)點(diǎn)。
最常規(guī)的反向染色是鋅染, 但是其他的金屬染色，比如銅染, 也是可以的。這種染色通過沉淀金屬到蛋白凝膠中, 然而SDS通過結(jié)合到蛋白上來
阻止沉淀。這樣產(chǎn)生了反向或負(fù)染色凝膠圖像因?yàn)槟z染為白色 (鋅)或綠色 (銅) 同時(shí)蛋白條帶是透明的，未染色. 這帶來了大量的優(yōu)點(diǎn)因?yàn)闊o需脫
色同時(shí)蛋白沒有因?yàn)槿玖系慕Y(jié)合而得到修飾。
另外一個(gè)優(yōu)勢是這種染色提供和銀染以及熒光染色同樣的靈敏度，以及它不會被蛋白翻譯后修飾所影響。這意味著所有的蛋白都可以被檢測
到。
反向染色經(jīng)常被忽視因?yàn)樗_實(shí)需要一些額外的技巧來操作，但是為了得到干凈，未染色的，未修飾的用于質(zhì)譜分析的蛋白這種額外的努力是
值得的。
