在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中遇到的質(zhì)控問(wèn)題之一最常見(jiàn)的就是高背景。當(dāng)一個(gè)高的背景發(fā)生時(shí)，很難從不相關(guān)的數(shù)據(jù)中區(qū)分出相關(guān)的數(shù)據(jù)。一個(gè)常見(jiàn)的高背景可以由于很多原因?qū)е峦瑫r(shí)需要一些工作來(lái)解決 -- 因?yàn)椴唤鉀Q這些問(wèn)題，這個(gè)印跡無(wú)法讀取.
1、保證緩沖液沒(méi)有被污染
一個(gè)被污染的緩沖液在免疫印跡中很容易導(dǎo)致高的背景。大多數(shù)情況下，由于細(xì)菌的存在會(huì)導(dǎo)致被污染的緩沖液 -- 但是也有其他的污染物. 當(dāng)
污染物進(jìn)入到緩沖液中后，他們會(huì)影響整個(gè)印跡的整體, 包括背景. 解決這種干擾唯一的辦法是將舊的緩沖液全部扔掉，重新配置新緩沖液。
2、確保操作步驟是完全恰當(dāng)?shù)?/span>
另外一個(gè)能夠?qū)е赂弑尘暗脑蚴菦](méi)有進(jìn)行恰當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E。差的膜操作，膜過(guò)度曝光， 以及不足的漂洗都會(huì)導(dǎo)致高背景。這些問(wèn)題可以通過(guò)
恰當(dāng)操作來(lái)解決。當(dāng)膜變干的時(shí)候膜的糟糕操作通常會(huì)發(fā)生。如果沒(méi)有使用正確的化學(xué)試劑恰當(dāng)?shù)臐?rùn)濕膜會(huì)變干; 通常來(lái)說(shuō)是甲醇.
膜的過(guò)度曝光也是一個(gè)問(wèn)題 -- 但是它很容易解決. 你所要做的是將膜曝光的時(shí)間縮短. 同樣的，不充分的漂洗只是需要將沖洗更加充分徹底. 漂洗用
來(lái)去掉過(guò)量的抗體. 當(dāng)很多抗體存在印跡上時(shí)，很難將印跡和背景區(qū)分開(kāi)來(lái)。改進(jìn)的漂洗也可以通過(guò)使用更好的漂洗溶液來(lái)進(jìn)行。
3、去除不充分的封閉
沒(méi)有正確的封閉, 免疫印跡的結(jié)果無(wú)法容易讀取. 不充分的封閉通常發(fā)生因?yàn)樵诜跤^(guò)程中的問(wèn)題. 如果孵育的時(shí)間不足夠長(zhǎng)，正確的區(qū)域不能
得到封閉. 如果孵育的溫度不正確的話,封閉也不能完成. 也有化學(xué)試劑可以加入到這個(gè)過(guò)程中來(lái)進(jìn)一步提高封閉.。
4、保證封閉劑的兼容性
封閉劑, 如同在印跡實(shí)驗(yàn)中使用的其他產(chǎn)品一樣，需要根據(jù)特定的應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整. 使用錯(cuò)誤的封閉劑很容易導(dǎo)致干擾和很差的難區(qū)分的印跡. 一
些封閉劑基于血清蛋白的，而其他的是基于蛋白的。不同的抗體可以和封閉劑有潛在反應(yīng)，所以有必要找到最合適的封閉劑. 無(wú)蛋白的封閉劑是最
好的封閉劑之一也是最容易的溶液。
5、降低抗體的濃度
通常高濃度的抗體會(huì)導(dǎo)致高的背景. 因?yàn)榭贵w濃度太高了，整個(gè)膜會(huì)被抗體所包被. 這會(huì)使得出決定性的結(jié)論很難. 當(dāng)提到高濃度的抗體，只有
很少一些解決方案可以解決。抗體可進(jìn)行恰當(dāng)漂洗或更低濃度的抗體可以被使用. 膜或許也需要恰當(dāng)?shù)奶幚?-- 只要沒(méi)有過(guò)度干掉 -- 它不會(huì)吸收很多
的抗體溶液.。
高背景也會(huì)發(fā)生當(dāng)使用的化學(xué)試劑和耗材不合適或質(zhì)量很差. 在免疫印跡中高背景是經(jīng)常顯著發(fā)生的多種問(wèn)題之一。
其他需要考慮的因素之前已經(jīng)討論了就是轉(zhuǎn)印膜的選擇: . 一個(gè)經(jīng)常被忽視的問(wèn)題是膜的效期. 在使用膜之
前, 確保它沒(méi)有過(guò)期同時(shí)被正確儲(chǔ)存。
